一、檢測原理

本試劑盒采用 ELISA 雙抗體夾心法原理。用純化的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體包被微孔板，向已包被板微孔中依次加入標準品及待測樣本，同時加入 HRP 標記的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 抗體，形成抗體 - 抗原 - 酶標檢測抗體復合物，經過洗滌后加入底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光值（OD 值），通過繪制標準曲線計算樣品中 SARS-CoV-2  Nucleoprotein 濃度。

二、試劑盒組成

三、其它實驗材料（不提供，但可協助購買）

1. 酶標儀 (主波長 450nm，參考波長 630nm)

2. 高精度可調移液器（已校準）及吸頭：0.5 - 10,2 - 20,20 - 200,200 - 1000μl。一次檢測樣本較多時，建議使用多通道移液器。

3. 自動洗板機或洗瓶

4. 微量振蕩器

5. 雙蒸水或去離子水

6. 坐標紙

7. 量筒

四、注意事項

8. 試劑盒保存在 2 - 8℃，未用完的標準品，建議丟棄。不可混合使用不同來源或不同批號的試劑盒組分，請在有效期內使用本產品。

9. 濃縮洗滌液低溫取出可能會伴有結晶析出，稀釋時可在水浴中加熱助溶，不影響使用。

10. 各步加樣均應使用移液器，并經過校準，以免產生誤差。建議一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內，如樣本數量較多，推薦使用排槍加樣。

11. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如樣本中待測物質含量高于試劑盒檢測上限（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣本稀釋液稀釋一定的倍數（n 倍）后再測定，計算時需乘以總稀釋倍數。

12. 為避免交叉污染，在加入不同濃度的標準品、不同樣本、不同試劑時謹記及時更換吸頭，封板膠紙只限一次性使用。

13. 濃縮酶結合物及顯色底物請避光保存，顯色底物在添加之前，應保持無色，請勿使用已變?yōu)樗{色的顯色底物。

14. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

五、樣本收集、處理及保存方法

15. 細胞上清液：將培養(yǎng)基移至離心管內，于 4℃下，1500rpm 離心 10 分鐘，取上清進行分裝并在 - 80℃下保存樣品，盡可能減少反復凍融次數。

16. 細胞提取物：吸取培養(yǎng)基并用預冷 PBS 洗滌細胞一次，吸出 PBS，在 100 mm 培養(yǎng)板加入 0.5ml 提取緩沖液。收集細胞至經過預冷的離心管中，短暫渦旋后在冰上孵育 15 - 30 分鐘，于 4℃下 13000rpm 離心 10 分鐘，將上清液（這里是指可溶性細胞提取物）分裝至預冷的離心管中，并于 - 80℃保存，盡可能減少反復凍融次數。

提取緩沖液：100 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM EDTA、1% Triton X - 100、0.5% 脫氧膽酸鈉、磷酸酶抑制劑混合物、蛋白酶抑制劑混合物、PMSF。

17. 若樣本無法立即檢測，請將其按最小使用量分裝， - 20℃ — - 80℃保存，避免反復凍融。如果樣本中含有大量顆粒，檢測前先離心或過濾去除；室溫下解凍，請勿于 37℃或更高的溫度加熱解凍。

18. 不能檢測含 NaN3 的樣本，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的活性。

19. 請根據實際情況，將樣本做適當倍數稀釋（建議根據預試驗結果確定稀釋倍數）。

六、試劑準備

20. 試劑回溫：請在實驗前 30min 內，將試劑盒和待測樣本置于室溫下回溫。

21. 洗滌液配制：根據濃縮洗液的濃縮倍數，用雙蒸水或去離子水進行相應倍數稀釋后備用。

22. 標準品梯度稀釋：取出試劑盒提供的標準品（25ng/ml），然后取 5 只聚丙烯試管，各加入 500μl 標準品 / 樣本稀釋液（S1），按照以下濃度進行 2 倍稀釋：25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78 ng/ml 進行稀釋。25ng/ml 為標準曲線最高點濃度，標準品 / 樣本稀釋液（S1）作為標準曲線的零點（0ng/ml）。使用過的標準品原液（25ng/ml）未用完的應廢棄或根據需要按照一次用量分裝，并將其貯存在 - 20～ - 80℃冰箱。

23. 檢測抗體工作液：根據試驗所需用量，用檢測抗體稀釋液（S2）將檢測抗體濃縮液（100×）稀釋成 1 倍應用工作液，請于 30min 內使用。

七、操作步驟

24. 加樣：根據試驗所需用量，取出相應抗體包被板條，分別將已配制好的標準品、標準品零點（S1）及待測樣本以 50μl / 孔加入實驗孔底部，盡量不觸及孔壁，同時，各實驗孔加入檢測抗體工作液（50μl / 孔），充分混勻。

25. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 90 分鐘。

26. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。

27. 顯色：每孔加入 100μl 顯色底物，用封板膠紙封板后室溫顯色 10 - 20min。

28. 終止：每孔加終止液 50μl（此時藍色立轉黃色）。

29. 測定：用酶標儀 450nm 波長測定各孔的吸光度（OD 值），測定應在加終止液后 5min 以內進行。

八、結果判斷

30. 建議采用雙波長讀數，即每個標準品和樣本的 450nm OD 值減去 630nm OD 值，為最終數值，如果做復孔，求其平均值。

31. 使用計算機軟件以吸光度 OD 值為縱坐標 (Y)，相應的 SARS-CoV-2Nucleoprotein 標準品濃度為橫坐標 (X)，生成標準曲線，樣本的 SARS-CoV-2 應稀釋倍數。

本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準

九、試劑盒性能

批內與批間差應小于 10%

十、檢測范圍

0.78 ng/ml - 25 ng/ml

十一、靈敏度

0.4 ng/ml

十二、常見問題分析及解決辦法