產(chǎn)品基本信息

• 檢測方法：微量法

• 產(chǎn)品規(guī)格：100T/96S

• 生產(chǎn)廠家：上海語燕生物技術(shù)有限公司

產(chǎn)品組成及保存條件

※ 正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。

簡介

意義

原理

自備用品

樣本的前處理

1. 細菌或培養(yǎng)細胞：

• 收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；

• 按細菌或細胞數(shù)量（10?個）：提取液體積（mL）=500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試劑 1），冰浴條件下超聲波破碎（功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；

• 8000g、4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：

• 按組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）=1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL ES480），冰浴勻漿；

• 8000g、4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，用蒸餾水調(diào)零。

2. 工作液的配制：臨用前將 B、C 和 D 轉(zhuǎn)移到 A 中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后 - 20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3. 將工作液置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）預(yù)熱 5 分鐘。

4. 測定操作（在微量石英比色皿或 96 孔板中加入下列試劑）：

注意：若 ΔA 大于 0.3，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定（使 ΔA 小于 0.3 可提高檢測靈敏度），計算公式中需乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

G6P 活性計算

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式

1. 血清（漿）G6P 活力計算
   單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/mL）=1608×ΔA
2. 組織、細菌或細胞中 G6P 活力計算
   （1）按樣本蛋白濃度計算
   單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/mg prot）=1608×ΔA÷Cpr
   （2）按樣本鮮重計算
   單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/g 鮮重）=1608×ΔA÷W
   （3）按細菌或細胞密度計算
   單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/10? cell）=3.215×ΔA

   注：V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10?3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

b. 用 96 孔板測定的計算公式

1. 血清（漿）G6P 活力計算
   單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/mL）=1608×ΔA
2. 組織、細菌或細胞中 G6P 活力計算
   （1）按樣本蛋白濃度計算
   單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/mg prot）=3216×ΔA÷Cpr
   （2）按樣本鮮重計算
   單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/g 鮮重）=3216×ΔA÷W
   （3）按細菌或細胞密度計算
   單位定義：每 1 萬個細胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。
   G6P（nmol/min/10? cell）=6.43×ΔA

   注：V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10?? L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

※ 蛋白定量檢測建議使用上海語燕生物技術(shù)有限公司的 BCA Protein Assay Kit。