試劑盒組成

使用方法

1、原代

1. 用離心管收集子宮內(nèi)膜癌組織樣本用組織保存液 D 保存，運(yùn)輸過(guò)程保持在 4°，轉(zhuǎn)運(yùn)至潔凈實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織處理和細(xì)胞分離，拍照并登記信息（操作流程契合語(yǔ)燕生物科研實(shí)驗(yàn)規(guī)范）。

2. 準(zhǔn)備若干 6cm 培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的緩沖液 F 備用，操作需符合語(yǔ)燕生物實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)。

3. 將組織放入培養(yǎng)皿中，用緩沖液 F 清洗三次后，利用眼科剪或手術(shù)刀等器械將組織剪切成體積約為 1-3mm³ 的小碎片。

4. 處理好多組織碎片用原代組織消化液 B 消化，37℃震蕩消化 30min-1.5h，（消化過(guò)程中隨時(shí)觀察消化情況，建議參照語(yǔ)燕生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）。

5. 取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個(gè)細(xì)胞或 70um 以下的細(xì)胞簇，加入三倍體積緩沖液 F 終止消化。

6. 使用 70um 孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，將濾液收集后，在 300g,4℃ 富集離心 5min 后移去上清，再加入 1-2mL 的紅細(xì)胞裂解液重懸，在冰上裂解紅細(xì)胞 1min，再加入適量緩沖液 F，300g，4°離心 5min，得到所需的細(xì)胞，該步驟可參考語(yǔ)燕生物科研操作規(guī)范。

7. 基質(zhì)膠計(jì)算：①第 6 步后觀察收集到的組織體積，添加 25 倍組織體積的基質(zhì)膠重懸鋪板。② 按照細(xì)胞計(jì)數(shù)，每 ul 基質(zhì)膠混勻 1×10?個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種。

8. 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠 25ul 組織基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（全程 4℃下操作，該操作細(xì)節(jié)經(jīng)語(yǔ)燕生物優(yōu)化）。

9. 將鋪好的培養(yǎng)板倒扣放入 37℃培養(yǎng)箱中 10-15min 使基質(zhì)膠凝固，然后添加子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基 A（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)（該培養(yǎng)條件經(jīng)語(yǔ)燕生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可提升類器官成活率）。

2、類器官傳代培養(yǎng)

9. 移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 4℃緩沖液 F 放置 2min，操作需輕柔，契合語(yǔ)燕生物實(shí)驗(yàn)操作要求。

10. 移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，吹散后收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min。（每 6-8 孔為一組）

11. a：類器官數(shù)量不足或體積較小時(shí)： 300g,4℃離心 5min 棄去上清，添加適量緩沖液 F 重懸移入 1.5ml 離心管，300g,4℃離心 5min 棄去上清進(jìn)行第 4 步。b：類器官數(shù)量較多或體積較大時(shí)：300g,4℃離心 5min 棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 C 消化 2-3min，添加緩沖液 F 終止消化，離心 5min 棄去混合液，添加適量緩沖液 F 重懸移入 1.5ml 離心管，300g,4℃離心 5min 棄去上清進(jìn)行第 4 步。

12. 類器官收集后，添加基質(zhì)膠重懸，每孔 25ul 基質(zhì)膠鋪在 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500ul 子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基 A，此步驟參考語(yǔ)燕生物傳代培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)。

3、類器官凍存

1. 移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加 1-2ml 4℃緩沖液 F 放置 2min。

2. 移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min。（每 6-8 孔為一組）

3. 300g,4℃離心 5min 棄去上清，添加適量緩沖液 F 再次重懸，300g,4℃離心 5min 棄去上清。

4. 添加適量類器官凍存液 E，輕柔吹打重懸，以 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例：密度為 2 個(gè)孔凍存 1 管，每管體積 1.4ml，凍存密度參考語(yǔ)燕生物科研建議。

5. 做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長(zhǎng)期保存。

4、類器官?gòu)?fù)蘇

6. 取 10ml 緩沖液 F 于 15ml 離心管中，緩沖液用量可根據(jù)語(yǔ)燕生物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)靈活調(diào)整。

7. 從液氮罐中取出凍存的類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。

8. 水浴融解過(guò)程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2min 內(nèi)融解。

9. 將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管，使用移液管輕輕吹打 6-8 次，300g,4℃離心 5min，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量緩沖液 F 重懸移入 1.5ml 離心管，300g,4℃離心 5min。

10. 基質(zhì)膠重懸，每孔 25ul 基質(zhì)膠鋪在 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 成膠，添加 500ul 子宮內(nèi)膜癌類器官培養(yǎng)基 A，復(fù)蘇后培養(yǎng)條件遵循語(yǔ)燕生物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

儲(chǔ)存/保存方法