主要用途

體外微管蛋白聚合作用（polymerization）熒光檢測試劑是一種旨在運(yùn)用微管聚合體熒光結(jié)合探針，通過熒光酶標(biāo)儀，分析樣品中微管蛋白聚合作用的動力學(xué)變化的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗證明的。主要適用于各種細(xì)胞或組織粗提或純化微管蛋白的聚合動力學(xué)分析，以及相關(guān)蛋白、抑制劑、誘導(dǎo)劑篩選。可以用于細(xì)胞周期的形態(tài)學(xué)研究，以及微管細(xì)胞骨架的蛋白分析。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

微管（microtubules）是細(xì)胞骨架的成分之一，構(gòu)成細(xì)胞漿中的基本結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)，在有絲分裂、胞質(zhì)分裂、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要作用。微管是微管蛋白（tubulin）的多聚體。微管蛋白分成5種亞型：α、β、γ、δ、ε。其中α和β微管蛋白（55Kd）形成異源二聚體，進(jìn)而多重聚合成微管原纖維（proto-filaments）。微管由13個原纖維構(gòu)成，直徑為25納米。每微米長微管由1650個異源二聚體組成。基于微管聚合體熒光結(jié)合探針DAPI，一旦特異整合，熒光強(qiáng)度顯著增加，通過熒光酶標(biāo)儀（360nm激發(fā)波長，420nm散發(fā)波長）分析微管蛋白聚合作用的動力學(xué)變化：聚集、快速形成和均衡穩(wěn)態(tài)的階段演變，由此可以進(jìn)行評價純化微管蛋白或裂解萃取液的聚合能力、篩選各種抑制劑和誘導(dǎo)劑等。

產(chǎn)品內(nèi)容

反應(yīng)液（Reagent A）             XX毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent B）             XX微升

產(chǎn)品說明書             1份

保存方式

保存在－70℃冰箱里，嚴(yán)禁反復(fù)凍融，避免光照；有效保證3月

用戶自備

微管蛋白：用于抑制劑和誘導(dǎo)劑篩選

黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于微管蛋白聚合分析

實(shí)驗步驟

實(shí)驗開始前，將－70℃冰箱里試劑盒中的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作：

1． 準(zhǔn)備好待測的粗提或純化微管蛋白樣品（100微克/10微升），置于冰槽里待測

2． 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀：溫度37℃，（360nm激發(fā)波長，420nm散發(fā)波長），間隔60秒，測讀31次（共30分鐘） 

3． 準(zhǔn)備好黑色96孔板，37℃預(yù)熱，并標(biāo)記好待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品

4． （選擇步驟）加入5微升用戶自備的待測抑制劑或誘導(dǎo)劑樣品

5． 移取XX微升反應(yīng)液（Reagent A）到37℃預(yù)熱的黑色96孔板的相應(yīng)孔里

6． 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育1分鐘

7． 加入10微升待測微管蛋白（100微克）樣品到待測樣品孔里

8． 加入XX微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent B）到標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里

9． 搖動黑色96孔板混勻

10． 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：獲得相對熒光單位吸（RFU）

11． 構(gòu)建樣品聚合反應(yīng)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對熒光單位吸（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為反應(yīng)時間（分鐘）

12． 抑制或誘導(dǎo)活性計算：

1) XX

2) IC50：5XX

3) 

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次操作量

2． 試劑嚴(yán)禁反復(fù)凍融

3． 操作時，須戴手套

4． 操作時，避免氣泡產(chǎn)生

5． 樣品避免含有NaCl、鈣離子等成分

6． 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent B）源自于豬腦微管蛋白，100微克/10微升

7． 標(biāo)準(zhǔn)樣品聚合作用后的熒光讀數(shù)3至4倍于0分鐘讀數(shù)

8． 建議使用紫杉醇（paclitaxel；終濃度3微摩爾）作為誘導(dǎo)劑對照

9． 建議使用噻氨酯噠唑（nocodazole；終濃度3微摩爾）作為抑制劑對照

10． 如果進(jìn)行抑制劑篩選，建議另購純化微管蛋白（tubulin）—12319

11． 本公司提供系列細(xì)胞骨架檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感