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支原體污染檢測(cè)試劑盒（PCR法）說(shuō)明-上海哈靈
點(diǎn)擊次數(shù)：1394 更新時(shí)間：2013-08-10
 
上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒（PCR法）-上海哈靈

（PCR Mycoplasma Detection Kit）
Cat number：YS012
Store at -20℃ for one year
Expire date：
For Research Use Only
 
一、 上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒說(shuō)明：

    本試劑盒經(jīng)過(guò)PCR法對(duì)細(xì)胞培育物、動(dòng)物分泌物等多種生物資料進(jìn)行支原體污染檢測(cè)。常規(guī)培養(yǎng)法進(jìn)行支原體檢測(cè)通常需求幾天的時(shí)間，而本試劑盒經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增及電泳分析進(jìn)行支原體檢測(cè)只需要幾個(gè)小時(shí)，既方便又快捷。本試劑盒的多對(duì)引物能特異性擴(kuò)增多種支原體rRNA基因片段，一次就能夠檢測(cè)至少11種的支原體，包含M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，M. orale，M. salivarium，M. hominis，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA堿基序列十分保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)如16S和23S間隔區(qū)，各種生物種間的堿基序列不一樣很大。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種間既有相對(duì)保守的部分，也有具有很大區(qū)別的部分。因而能夠在編碼16S和23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)，然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條引物進(jìn)行嵌套式PCR。能特異性檢測(cè)出支原體DNA，檢測(cè)靈敏度與特異性都很高。
 
二、上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒組份：

    組份 012（20 assays） 貯存條件  10×Taq Buffer（不含Mg2＋） 1.0 mL -20℃  MgCl2（25mM） 1.0 mL -20℃  Taq DNA Polymerase（5 U /μl） 100 U -20℃  Myc F1 Primer （10μM） 50μL -20℃  Myc R1 Primer（10μM） 50μL -20℃  Myc F2 Primer（10μM） 50μL -20℃  Myc R2 Primer（10μM） 50μL -20℃  Control Template（1 ng/μl） 50μL -20℃  DNA溶解液 2 mL -20℃  ddH2O 5 mL -20℃  
三、試劑盒以外自備儀器和試劑
電泳儀、離心機(jī)、PCR儀、凝膠成像儀、微量移液器、dNTPs（10mM）、瓊脂糖、溴化乙錠等
四、運(yùn)用注意事項(xiàng)
整個(gè)試驗(yàn)，必須標(biāo)準(zhǔn)操作，反應(yīng)系統(tǒng)的配置、樣本處置及加樣、PCR擴(kuò)增應(yīng)分區(qū)域進(jìn)行，以避免交叉污染。 
 
上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒操作方法：

1.收取待檢樣品（細(xì)胞通常成長(zhǎng)至80％左右即可，貼壁細(xì)胞不宜用消化液消化細(xì)胞，可以運(yùn)用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞），然后取細(xì)胞懸液200ul（約1～3×105細(xì)胞數(shù)）至離心管，12000rpm離心5～10min；去除上清，加入50ul DNA溶解液，充分懸浮沉淀物，沸水浴5min；樣品運(yùn)用前12000rpm離心5～10min，取上清4ul作為PCR反應(yīng)模板；剩下樣品能夠-20℃保藏。樣本有時(shí)也能夠直接用污染液直接做PCR反應(yīng)。
上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒PCR反應(yīng)：

*步PCR：
50μL系統(tǒng)PCR反應(yīng)（如客戶需求運(yùn)用更小量的反應(yīng)系統(tǒng)，試劑加樣量按份額進(jìn)行削減）：
（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；
（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管，在冰上順次參加
10×Taq Buffer                   5  μL
dNTPs （10mM）                  1  μL
MgCl2 （25mM）                  4  μL
Myc F1 （10μM）                 1  μL
Myc R1 （10μM）                 1  μL
DNA樣品                      1~5 μL
Taq DNA Polymerase             0.5 μL
ddH2O up to                     50 μL
（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s；
（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
第二步PCR：
50μL系統(tǒng)PCR反應(yīng)（如客戶需求運(yùn)用更小量的反應(yīng)系統(tǒng)，試劑加樣量按份額進(jìn)行削減）：
（1）．使用前每個(gè)組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；
（2）．取滅過(guò)菌的0.2mL離心管，在冰上順次加入
10×Taq Buffer                   5  μL 
dNTPs （10mM）                  1  μL
MgCl2 （25mM）                  4  μL
Myc F2 （10μM）                 1  μL
Myc R2 （10μM）                 1  μL
*步產(chǎn)品                    1~5 μL
Taq DNA Polymerase             0.5 μL
ddH2O up to                     50 μL
（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s；
（4）．進(jìn)行PCR擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增條件：
94°C，5min；
94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；
72°C，10 min，
3.反應(yīng)完畢后，取反應(yīng)液10μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，承認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)品。若是此PCR產(chǎn)品需用于今后試驗(yàn)，應(yīng)將PCR產(chǎn)品冷凍保管。
4.依據(jù)感染支原體類型的不一樣，擴(kuò)增產(chǎn)品大小有所不一樣，*步PCR產(chǎn)品在350～700bp 之間，第二步PCR產(chǎn)品在150～250bp之間。
線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）
TRAP-PCR端粒酶活性檢測(cè)試劑盒
以上信息為上海哈靈支原體污染檢測(cè)試劑盒的詳細(xì)內(nèi)容！
 
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